PCR (polymerase chain reaction) ou AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE

L'évolution de la PCR est dictée par les questions posées

Avant que la PCR ne devienne un outil polyvalent, de nombreuses modifications ont été apportées au schéma initial. Au début des années 1980, les chercheurs devaient passer les tubes d'un bain-marie, à une certaine température, à un autre pour modifier la température de réaction et ajouter une nouvelle enzyme après chaque dénaturation. La Taq polymérase, ajoutée une seule fois en début de cycle, a permis l'automatisation de la PCR, ce qui a assuré son succès. La Taq polymérase est une enzyme initialement extraite d'une bactérie (Thermus aquaticus) des sources chaudes (80-90 ⁰C) du Steamboat Geyser dans le parc de Yellowstone, aux États-Unis. Sa température optimale d'action est de 72 ⁰C, et elle est capable de résister à des températures allant jusqu'à 100 ⁰C. Pendant la PCR, elle résiste donc aux alternances de chauffage et de refroidissement, et permet une amplification efficace. Les étapes de la réaction sont réalisées automatiquement et sans interruption dans un thermocycleur – un bloc programmable où la température peut varier très rapidement et très précisément de 0 ⁰C à 100 ⁰C. La stabilité thermique de la Taq polymérase a ainsi permis d'automatiser les cycles d'amplification. Des améliorations successives ont rendu l'usage des thermocycleurs plus commode et ont permis d'augmenter considérablement le nombre d'échantillons amplifiés simultanément. Il existe une gamme d’appareillages permettant de traiter, selon les besoins, quelques dizaines d’échantillons, ou plusieurs milliers comme lors de la surveillance d’une infection épidémique ou pandémique (Covid-19, grippe aviaire…).

Mais c'est surtout dans le domaine des réactifs que les innovations ont été le plus notables. De nombreux additifs permettent de faire varier la spécificité (c'est-à-dire la possibilité que la réaction se fasse en dépit d'une hybridation imparfaite des amorces sur l'ADN, ce qui est nécessaire lorsque la séquence n'est pas exactement connue), la sensibilité (c'est-à-dire la capacité de la réaction de se faire malgré le faible nombre de molécules cibles dans la matrice initiale) et enfin l'efficacité de la PCR.

De nombreux types de polymérases ont également vu le jour, afin de pallier les limitations de la Taq polymérase naturelle. Par exemple, la Taq étant partiellement fonctionnelle à température ambiante – ce qui provoque des départs anormaux –, il est nécessaire de préparer le mélange réactionnel sur glace. L'invention des polymérases dites hot start a permis d’éliminer ce problème : une molécule (une protéine ou un anticorps, par exemple), comparable à un « boulet de bagnard » moléculaire, est attachée à la polymérase et l'empêche de fonctionner ; la première dénaturation thermique de la PCR détache le boulet et active l'enzyme, augmentant la sensibilité et la spécificité tout en simplifiant la mise en œuvre de la réaction. De même, des polymérases dites à haute fidélité (« HiFi Taq ») ont vu le jour. Elles diminuent le taux naturel d'erreurs de la Taq (d'environ 1 pour 10 000 bases) par l'ajout, notamment, d'une activité de relecture et de correction des brins néosynthétisés.

Les modifications les plus récentes de la PCR ont consisté à améliorer une des conditions réactionnelles pour l'adapter aux besoins de l'expérience :

– La touchdown PCR consiste à faire varier la température d'hybridation au cours des cycles. Cette technique est fréquemment utilisée pour distinguer entre deux gènes de séquence très semblable comme peuvent l’être deux variants d'un même virus. Les premiers cycles sont réalisés à une température élevée et permettent donc une amplification particulièrement[...]