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PCR (polymerase chain reaction) ou AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE

Les étapes d'une PCR classique

Quelle que soit l'opération menée, l'extraction de l'ADN précède son amplification. L'ADN est extrait à partir de l'échantillon qu'on souhaite analyser (salive, sang, cheveux, prélèvement issu d'une biopsie, poudre d'os actuel ou ancien, etc.). L'opération peut être menée à partir d'une seule cellule, un spermatozoïde par exemple, voire de fragments dégradés de l'ADN. Des microméthodes d'extraction ont donc été mises au point.

C'est à ce stade que se situe la principale difficulté de la PCR : une contamination par un ADN étranger fausserait les résultats s’il était amplifié en même temps ou à la place de l'ADN qu'on souhaite étudier. Pour éviter de telles contaminations, des pièces séparées dans le laboratoire sont réservées à chaque étape : extraction d'ADN ; préparation du mélange réactionnel ; amplification elle-même ; étude des produits amplifiés enfin. De plus, on utilise un matériel stérile (récipients, pipettes, etc.) à chaque étape ; les réactifs sont également stérilisés et préparés en petites fractions correspondant au volume suffisant pour une seule expérience ; l'opérateur porte un masque et des gants. L’étape suivante, la conception des amorces d'amplification, est également critique. Il faut en effet construire les amorces pour la réaction d'amplification en les adaptant à chaque situation. Pour ce faire, il est nécessaire de connaître les séquences de nucléotides qui encadrent la séquence d'ADN qu'on souhaite amplifier et de choisir celles qui ne provoqueront pas de réactions parasites. Les amorces s'accordant aux séquences complémentaires de ces fragments sont produites dans un synthétiseur d'ADN.

Tous les éléments nécessaires à la réaction sont ensuite mélangés dans un même tube contenant un milieu réactionnel adapté aux caractéristiques optimales pour le bon fonctionnement de l'enzyme. Ce sont : l'ADN total extrait qui contient l'ADN à amplifier, servant de matrice lors des premiers cycles d'amplification ; une polymérase thermostable ; les deux amorces en très forte concentration initiale ; les nucléotides (A, T, G, C) qui seront intégrés par la polymérase dans le brin d'ADN qu'elle synthétise.

La réaction d'amplification consiste en une succession de vingt à quarante cycles, qui comportent chacun trois étapes d'une durée de quelques secondes à quelques minutes à des températures différentes :

– La dénaturation thermiquede l'ADN. Les fragments d'ADN sont chauffés à haute température (aux alentours de 95 0C). L'ADN double brin est dénaturé en ADN simple brin qui devient accessible aux amorces.

– L 'hybridation des amorces. Le mélange réactionnel est refroidi rapidement (températures de 45 à 60 0C), ce qui permet l'appariement des amorces à leurs régions complémentaires dans les brins d'ADN.

– L'extension, ou élongation (polymérisation). Elle correspond à l'élongation unidirectionnelle de chaque amorce hybridée par l'enzyme polymérase (le plus souvent aux alentours de 72 0C). L'enzyme copie le brin d'ADN matrice en ajoutant des nucléotides à l'une des extrémités de chaque amorce : un A en face d'un T, un G en face d'un C ; bref, elle copie exactement, en respectant les règles d'appariement. Le résultat est un ADN double brin.

Après l'extension, le cycle recommence, à la différence près que les fragments précédemment synthétisés servent de matrice pour la synthèse de nouveaux fragments d'ADN : après quelques cycles, l'ADN néosynthétisé se comporte comme la matrice dominante. Le taux d'amplification théorique est de 2n, n étant le nombre de cycles. Pour trente cycles, à partir[...]

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Écrit par

  • : maître de conférences au Muséum national d'histoire naturelle, Paris

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Classification

Pour citer cet article

Véronique BARRIEL. PCR (polymerase chain reaction) ou AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE [en ligne]. In Encyclopædia Universalis. Disponible sur : (consulté le )

Médias

Généalogie du dodo - crédits : Illustration by Christian Friedrich Stölzel

Généalogie du dodo

Illustration by Christian Friedrich Stölzel

Appariement des brins d’ADN - crédits : Encyclopædia Universalis France

Appariement des brins d’ADN

Encyclopædia Universalis France

Cinétique d’une réaction de PCR - crédits : Encyclopædia Universalis France

Cinétique d’une réaction de PCR

Encyclopædia Universalis France

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Autres références

  • POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

    • Écrit par Nicolas CHEVASSUS-au-LOUIS, Universalis
    • 296 mots

    En 1985, une équipe de chercheurs de la jeune firme de biotechnologie californienne Cetus, publient dans Science le premier article décrivant une technique qui permet d'amplifier plusieurs centaines de milliers de fois un fragment d'ADN – ici le gène d’une globine humaine – applicable...

  • BACTÉRIOLOGIE

    • Écrit par Jean-Michel ALONSO, Jacques BEJOT, Michel DESMAZEAUD, Didier LAVERGNE, Daniel MAZIGH
    • 18 329 mots
    • 11 médias
    ...une sensibilité permettant de détecter parfois jusqu'à une seule copie d'une séquence génomique spécifique. La méthode la plus connue est la réaction de polymérisation en chaîne, ou P.C.R. (pour polymerase chain reaction). Elle utilise la propriété de l'enzyme ADN polymérase de synthétiser le brin complémentaire...

  • BIOLOGIE - La biologie moléculaire

    • Écrit par Gabriel GACHELIN
    • 7 405 mots
    • 8 médias
    Transcription de l'ADN en ARNm - crédits : Encyclopædia Universalis France
    ...définies de plus en plus longues et maintenant d'ARN, ce qui permet nombre de développements techniques. Enfin, une technique majeure introduite en 1985, la polymerase chain reaction (PCR), permet l'amplification d'à peu près n'importe quelle séquence d'ADN à partir de quantités aussi faibles que l'ADN...

  • DENGUE

    • Écrit par Philippe DESPRÈS
    • 2 880 mots
    • 4 médias
    Pendant la phase aiguë de la maladie, la virémie est recherchée parPCR en temps réel, laquelle utilise des couples d'amorces capables de reconnaître toutes les souches virales ou, au contraire, spécifiques de chacun des sérotypes de la dengue. L'isolement viral à partir d'un sérum virémique est réalisé...

  • DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

    • Écrit par Yannick SIMONIN
    • 5 194 mots
    • 4 médias
    Principe de la séroneutralisation - crédits : Encyclopædia Universalis France
    ...et cellulaires, ce qui permet d’extraire le génome viral normalement protégé à l’intérieur des capsides virales ou au sein des cellules infectées. L’amplification génique peut ensuite être effectuée. Elle repose sur latechnique de polymérisation en chaîne (PCR pour polymerase chain reaction).
  • Afficher les 23 références

Voir aussi

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