GÉNOMIQUELa transgenèse

On qualifie de transgenèse la transformation intentionnellement opérée dans le patrimoine génétique « naturel » (ou encore « sauvage ») d'une espèce pour créer des populations dites transgéniques constituées d'organismes génétiquement modifiés (O.G.M.) ayant acquis une nouvelle caractéristique liée à l'expression du transgène.

Les techniques de transfert de gènes dans les organismes, qu'il s'agisse d'animaux ou de végétaux, sont employées dans des domaines extrêmement variés allant de l'amélioration des espèces à la création de modèles animaux de maladies humaines, de la production de molécules d'intérêt thérapeutique, à l'interprétation de mécanismes biologiques complexes : oncogenèse, mise en place du système immunitaire, différenciation, développement...

Les souris transgéniques

La transgenèse a permis de créer des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Des mécanismes complexes – mise en place du système immunitaire, mécanisme d'action des oncogènes, etc. –, qui font intervenir de multiples régulations et interactions cellulaires, deviennent dès lors accessibles à l'analyse.

Obtention de souris transgéniques

Les souris transgéniques ont d'abord été obtenues par micro-injection de gènes clonés dans l'œuf de souris. Cette micro-injection est réalisée, avant la fusion des noyaux d'origine paternelle et maternelle, dans celui des deux noyaux qui est le plus accessible et le plus gros, à savoir (le plus souvent) le pronucleus mâle. La manipulation est réalisée sous microscope à l'aide de deux micromanipulateurs ; l'un permet d'immobiliser l'œuf par légère aspiration à l'extrémité d'une pipette et l'autre d'injecter l'ADN (cf. figure). Les œufs sont ensuite réimplantés dans l'utérus de femelles préalablement accouplées avec des mâles vasectomisés. Ces femelles, dites pseudogestantes, se trouvent (ou ont été mises) dans un état hormonal permettant l'implantation et le développement des embryons. De 20 à 30 p. 100 environ des souriceaux obtenus ont intégré dans leurs chromosomes l'ADN injecté et sont dits transgéniques.

Le mécanisme par lequel l'ADN s'intègre dans les chromosomes n'est pas connu, mais, par cette technique, on le retrouve le plus souvent à raison de plusieurs copies intégrées en tandem tête à queue (l'extrémité droite d'une copie est suivie de l'extrémité gauche de la suivante), en un site unique ou en un nombre réduit de sites. Aucune spécificité quant à ces sites d'intégrations n'a, à ce jour, été détectée. Les nombreux réarrangements qui ont lieu lors de l'intégration rendent d'ailleurs difficiles le clonage et l'analyse des sites d'intégration. L'avantage de cette méthode est l'obtention d'un pourcentage élevé de lignées transgéniques qui expriment les gènes introduits de façon prévisible d'après les séquences régulatrices qui gouvernent leur expression. Les surprises sont cependant fréquentes et le plus souvent liées au site d'intégration. En effet, lorsqu'un transgène s'intègre à proximité de séquences régulatrices endogènes, des interférences peuvent se produire entre celles-ci et les propres séquences régulatrices du transgène. Les modes d'expression du transgène pourront alors être fort différents de ceux qui étaient escomptés.

Une autre technique, beaucoup moins utilisée, consiste à infecter des embryons à l'aide de rétrovirus à génome remanié autrement dits recombinants. Le principal avantage de cette méthode est la possibilité d'introduire le virus à différents stades au cours du développement embryonnaire, permettant l'obtention d'animaux chimériques dans lesquels seules les cellules issues de celles qui ont été infectées portent le transgène. Le second avantage résulte du mode d'intégration de l'ADN rétroviral : le transgène n'est présent qu'à raison d'une copie par cellule et les sites d'intégration ne sont pas bouleversés. Cette dernière caractéristique rend possible le clonage et l'analyse des sites d'intégration et peut être d'un réel intérêt pour identifier des gènes éventuellement interrompus par l'intégration du transgène. Il existe, en revanche, deux inconvénients majeurs : la taille des fragments que l'on peut insérer dans un virus est limitée ; l'expression des transgènes n'est pas aussi reproductible qu'avec la méthode précédente.

La troisième technique utilise comme cellule hôte des cellules souches embryonnaires (E.S.) prélevées dans un blastocyste, c'est-à-dire un embryon non implanté âgé, pour la souris, de quatre jours et demi. Ces cellules peuvent être cultivées sans perdre leur totipotentialité, c'est-à-dire leur capacité de contribuer ultérieurement au développement d'une souris. On peut y transférer un gène par infection à l'aide d'un virus, par micro-injection ou encore par électroporation, technique de loin la plus fréquemment utilisée. Après cette opération de transfert du gène d'intérêt, les cellules souches sont réintroduites dans la cavité d'un blastocyste. Après réimplantation, un souriceau « mosaïque » se développera, dans lequel toutes les cellules issues des cellules souches infectées porteront le transgène. Le principal avantage de cette technique est qu'une sélection des cellules souches exprimant le transgène est possible. Si les transgènes sont partiellement homologues de gènes endogènes et associés à des gènes de sélection, cette technique permet la sélection ou la reconnaissance des cellules dans lesquelles le remplacement d'un gène endogène par son homologue transgénique a eu lieu. Seules ces cellules seront alors réimplantées dans le blastocyste, ouvrant le champ à la création de modèles animaux porteurs de diverses mutations ou, à l'inverse, à leur correction. Depuis le début des années 1990, cette technique reposant sur la sélection d'événements de recombinaison entre séquences d'ADN homologues s'est considérablement développée. Plus précise que la transgenèse par addition de gènes au hasard dans le génome, l'utilisation des cellules E.S. pour réaliser précisément des invalidations de gènes a même réussi à supplanter la transgenèse classique.

Si les techniques de base de la transgenèse murine ont assez peu évolué au niveau du mode de transfert, des améliorations notables ont été apportées dans la conception des transgènes. L'objectif a été en particulier d'obtenir des modèles dans lesquels l'expression du transgène peut être induite ou arrêtée à volonté par l'expérimentateur. Une telle régu [...]

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Souris transgénique et oncogenèse
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