ADN : confection de banques complémentaires

ADN : confection de banques complémentaires

Crédits : Encyclopædia Universalis France

Principe de la confection de banques d'ADN complémentaires. En 1, les ARN messagers d'un tissu sont recopiés en un brin complémentaire d'ADN par extension d'amorce à l'aide de la transcriptase inverse. L'amorce la plus souvent utilisée est ici un homopolymère d'acide thymidilique, complémentaire de l'extension d'acide polyadénylique prolongeant généralement les ARN messagers eucaryotiques. En 2, après destruction des ARN, ou simplement dénaturation des hybrides ARN/ADN, les ADNc simple-brins sont eux-mêmes recopiés par extension d'amorce donnant naissance à un second brin, complémentaire du précédant.En 3, l'ADNc double brin est intégré dans un vecteur qui est soit un plasmide (c'est-à-dire un élément génétique à replication autonome dans la bactérie), soit un phage. En 4, des bactéries sont « transformées » par intégration du vecteur recombiné, chacune d'entre elles, qui sera à l'origine d'une colonie, ne pouvant intégrer qu'une seule molécule de vecteur… et donc un seul type d'ADNc. Ces bactéries transformées sont dispersées sur des boîtes de milieu de culture de telle sorte qu'elles soient à l'origine de colonies séparées. En 5, le criblage, c'est-à-dire la détection parmi les colonies de celles qui sont transformées par le vecteur ayant intégré l'ADNc complémentaire du messager étudié, se fait de deux manières : le criblage par hybridation moléculaire, souvent à l'aide d'oligonucléotides synthétisés d'après une portion connue de la séquence de la protéine codée par le messager étudié, se fait comme cela est indiqué dans la figure 12 ; le criblage par expression consiste à reconnaître à l'aide d'anticorps, et parfois par son activité biologique, la protéine codée par l'ADNc intégré dans le vecteur transformant les colonies recherchées.