Séquençage de l’ADN par synthèse dans la méthode Illumina®

Séquençage de l’ADN par synthèse dans la méthode Illumina<sup>®</sup>

Crédits : Encyclopædia Universalis France

Le séquençage de l'ADN par la méthode Illumina® commence par une amplification par PCR en « pont » (a). Les molécules d'ADN simple brin spatialement éloignées les unes des autres sont fixées à la lame par complémentarité avec une amorce contenue dans les adaptateurs (deux types d'amorces sur la lame). Chaque fragment est amplifié, l'ADN double brin néoformé est dénaturé et le brin d'origine est éliminé. Le nouveau brin, là encore via la séquence des extrémités correspondant à la zone des adaptateurs, va aller s'hybrider au deuxième type d'amorce pour former un « pont » et être amplifié sous cette forme. Une fois « libérés », les deux brins complémentaires vont à nouveau subir le même processus et former ainsi des amas ou clusters à la surface de la lame. Pour chaque cluster (regroupant un fragment identique), la base « fluorescente » correspondant au brin en cours d'élongation (et complémentaire à la base du brin matrice) va être ajoutée, et va « bloquer » temporairement la réaction d'élongation (b). Sachant que chacune des quatre bases (A, C, G et T) est couplée à un fluorochrome différent, la plaque peut être scannée dans les quatre couleurs pour identifier quelle base a été incorporée pour chaque massif (cluster). Après excision des groupements fluorescents, qui redonne par la même occasion la possibilité d'une autre étape d'élongation, l'opération est renouvelée avec l'ajout d'une nouvelle série de dNTP marqués.