SÉQUENÇAGE HAUT DÉBIT DE L'ADN

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Le séquençage « historique et classique » de l’ADN : la méthode de Sanger

Le séquençage consiste donc à déterminer l'ordre dans lequel se succèdent, de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’, les quatre types de nucléotides (A, C, G, T) qui composent une molécule d’ADN. Après quelques différentes réalisations sporadiques (premiers résultats en 1963 fondés sur une chimie complexe), le séquençage dit de première génération – encore utilisé aujourd’hui – et développé sur la méthode de Frederick Sanger – son inventeur en 1977 qui reçoit pour cela son second prix Nobel en 1980 – s’affirme à la fin des années 1970, presque vingt ans après la découverte de la structure de l'ADN. Il repose sur le mécanisme de réplication de l’ADN, au cours duquel la matrice ADN sous forme simple brin est recopiée par une enzyme, l’ADN polymérase, qui allonge un brin complémentaire à partir d’un petit fragment, l’amorce, en utilisant les quatre différents dNTPs présents dans le milieu. Une amorce (primer en anglais) est une courte séquence d’ADN synthétisée chimiquement qui se fixe exactement sur une séquence complémentaire (hybridation) de l’ADN simple brin, reconstituant localement un court ADN double brin à partir duquel toutes sortes d’opérations, telles que la copie ou l’amplification, sont réalisables. Lors d’une réaction de séquençage, les quatre dNTP sont donc ajoutés, ainsi qu’une faible proportion de didésoxyribonucléotides (ddNTP, qui diffèrent des dNTP par l’absence d’un groupe OH sur leur ribose, empêchant l’ajout d’un nucléotide suivant lors de l’élongation). Chacun des quatre ddNTP est couplé à un marqueur fluorescent distinct, rendant possible leur lecture multiplexe lors de la réalisation des séquences. Lorsqu’un ddNTP s’incorpore, il empêche la fixation du nucléotide suivant, stoppant ainsi l’élongation. Il résulte de cette dernière un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, selon l’endroit où le ddNTP s’est incorporé. Si l’on sépare ces fragments marqués dans un champ électrique (électrophorèse), l’échelonnement des ma [...]

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Exemple de diversité au sein d’un gène

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Détermination classique de la séquence d’un fragment d’ADN

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Principe de la PCR en émulsion (Ion Torrent®)

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Séquençage de l’ADN par synthèse dans la méthode Illumina®

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Véronique BLANQUET, Nathalie DUPRAT, Lionel FORESTIER, « SÉQUENÇAGE HAUT DÉBIT DE L'ADN », Encyclopædia Universalis [en ligne], consulté le 17 janvier 2021. URL : https://www.universalis.fr/encyclopedie/sequencage-haut-debit-de-l-adn/