GÉNOMIQUELe séquençage des génomes

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Méthodologie du séquençage

Obtention de l'ADN à séquencer

Le clonage est indispensable, sauf cas particulier, pour toute étude détaillée de l'ADN d'un organisme et en particulier pour son séquençage : c'est lui qui permet de disposer de l'ADN de ce génome sous une forme pure et utilisable. En pratique, les fragments d'ADN de l'organisme à étudier sont associés à un vecteur et introduits dans un hôte (souvent une bactérie, parfois une levure). Chaque bactérie (ou levure) ayant reçu un fragment de l'ADN exogène donne naissance à une colonie, un clone formé d'individus identiques et contenant le même segment d'ADN exogène, que l'on peut ainsi produire à volonté.

Les vecteurs employés en biologie moléculaire « classique » dérivent soit de plasmides naturellement présents dans les bactéries et modifiés de manière à emporter un segment d'ADN exogène, soit de virus bactériens comme le bactériophage lambda (également modifié), soit de constructions comme les cosmides réalisées à partir d'éléments empruntés aux vecteurs précités. La taille des fragments d'ADN incorporés va de quelques centaines de bases jusqu'à trente ou quarante milliers de bases (kilobases) pour les cosmides. Ces tailles sont bien adaptées pour nombre d'études, mais sont insuffisantes pour l'étude de grands génomes : un chromosome humain contient environ cent à cent cinquante millions de bases d'ADN et son clonage sous forme de fragments contenus dans des cosmides aboutit à des milliers de clones. Le repérage de la région du chromosome dont provient chaque cosmide devient alors très malaisé.

Les besoins de l'étude des génomes ont motivé la mise au point de systèmes de clonage capables de transporter de très grands fragments d'ADN. Le premier d'entre eux a été le système des chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosomes) qui « déguise » un grand segment d'ADN exogène en chromosome de levure en lui ajoutant quelques segments d'ADN de levure, permettant ainsi sa propagation dans cet organisme. Ce système, qui peut traiter des segments allant jusqu'à une mégabase, a joué un rôle important dans l'obtention des premières cartes physiques du génome humain. Il présente néanmoins de nombreux défauts (instabilité des clones en particulier) et a ensuite été supplanté par d'autres vecteurs, principalement les BAC (bacterial artificial chromosomes) qui permettent de propager (dans des bactéries cette fois) des segments de plusieurs centaines de kilobases et présentent une fiabilité et une facilité de manipulation très supérieures. Quel que soit le système employé, le passage d'un chromosome humain entier (contenant une centaine de millions de bases d'ADN) au déchiffrage proprement dit (qui se fait par zone de quelques centaines de bases) suppose une « cascade » de clonages successifs (fig. 1).

Clonage et sous-clonages

Dessin : Clonage et sous-clonages

De haut en bas, chromosome (environ 100 mégabases d'ADN), segment cloné dans un chromosome artificiel de levure (environ 500 kilobases), sous-clonage d'une partie de ce dernier dans un cosmide (environ 30 kilobases), carte du segment cloné (avec indication des sites de coupure par des enzymes... 

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Analyse par électrophorèse

La méthode employée aujourd'hui est celle de Sanger, publiée dès 1977, qui a fait l'objet de multiples améliorations et d'une automatisation partielle mais dont le principe est resté le même (cf. acides nucléiques).

Le séquençage d'un segment d'ADN contenant quelques dizaines de milliers de bases commence en général par sa fragmentation en de nombreux morceaux plus petits qui sont alors « sous-clonés » dans un vecteur particulier, le bactériophage m13, qui présente la particularité de faciliter la préparation d'ADN simple brin sur lequel sera réalisé le séquençage.

L'étape cruciale sera la synthèse du brin d'ADN complémentaire du brin à séquencer. Elle est effectuée par une enzyme, l'ADN polymérase, à partir d'une « amorce », et en présence d'une faible proportion d'un nucléotide modifié appelé terminateur dont l'incorporation dans la chaîne arrête la copie de l'ADN à séquencer (cf. acides nucléiques). Pour la réaction effectuée, par exemple, en présence de G modifié (ainsi que d'une certaine quantité de G normal, de A, T et C), le résultat sera un mélange de chaînes polynucléotidiques néo-synthétisées commençant toutes au même endroit (celui de l'amorce) et se terminant toujours par G mais de longueur inégale en fonction de la position de celui-ci dans l'ADNc copié.

Trois autres réactions de synthèse sont effectuées, en présence cette fois d'analogues de A, T ou C. Les quatre mélanges de fragments ainsi obtenus (qui ont été rendus radioactifs ou fluorescents) sont ensuite a [...]

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Taille de divers génomes

Taille de divers génomes
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Clonage et sous-clonages

Clonage et sous-clonages
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Position d'un nucléotide dans l'ADN

Position d'un nucléotide dans l'ADN
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Exploration du génome et bio-informatique, B. Jordan

Exploration du génome et bio-informatique, B. Jordan
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Pour citer l’article

Bertrand JORDAN, « GÉNOMIQUE - Le séquençage des génomes », Encyclopædia Universalis [en ligne], consulté le 22 mai 2022. URL : https://www.universalis.fr/encyclopedie/genomique-le-sequencage-des-genomes/