FERMENTATIONS

La fermentation alcoolique est la plus anciennement étudiée. Elle correspond à la transformation des sucres en alcool éthylique et anhydride carbonique. Elle est utilisée pour la fabrication de toutes les boissons alcooliques (en particulier le vin). Par le gaz carbonique dégagé, elle intervient dans la levée de la pâte en boulangerie et en pâtisserie. Lavoisier montra que les quantités de carbone, d'hydrogène et d'oxygène de l'alcool et du gaz produits égalaient celles de ces éléments dans le sucre consommé. Gay-Lussac, en 1810, définit l'équation chimique de la réaction globale :

La présence indispensable de levures pour la réalisation du processus était interprétée comme la nécessité d'un facteur physique, mais ne jouant pas de rôle chimique. En 1837 et 1838, C. Cagniard de la Tour, T. Schwann et F. Kutzing publièrent séparément leurs observations microscopiques et conclurent que la levure est un organisme vivant qui se reproduit par bourgeonnement. Schwann nomme ce micro-organisme « champignon du sucre » et considère la fermentation comme « la décomposition du sucre par ce champignon, qui en retire le matériel nécessaire à sa croissance et à sa nutrition ». Les « autorités » de l'époque, Wöhler, Liebig, Berzelius, s'insurgèrent contre cette conception taxée de vitalisme. Selon eux, la levure devait intervenir par une action catalytique de surface ou par transmission de « vibrations moléculaires ».

À partir de 1857, Pasteur, appelé par les brasseurs du nord de la France pour trouver les causes d'incidents de fabrication, étudia en détail le phénomène et aboutit aux conclusions suivantes : le phénomène se déroule en absence d'oxygène ; les levures demeurent parfaitement saines et peuvent même se multiplier au cours du processus ; ces mêmes levures sont capables également de vivre et de se multiplier en aérobiose.

Les travaux de Büchner, qui, en 1897, prépara un suc de levures dépourvu totalement de cellules, mais capable de transformer le glucose en éthanol et en CO₂, puis ceux de Harden et Young, qui, en 1905, fractionnèrent le suc obtenu par Büchner, nommé zymase, en une partie thermostable (cozy-mase) et une partie thermolabile (apozymase), sont parmi les plus importants de ceux qui ont contribué au développement de la biochimie et de l'enzymologie modernes. Ces travaux supprimèrent la distinction, admise alors, entre ferments organisés (les catalyseurs ne pourraient être que des êtres vivants) et ferments inorganisés (les catalyseurs étant des extraits) ; ils établirent définitivement les notions d'apoenzyme et de coenzyme ; enfin leurs prolongements, par de nombreux chercheurs, aboutirent à la mise en évidence du processus fondamental de dégradation des glucides (glycolyse).

Les agents de la fermentation alcoolique sont :

– principalement les levures, champignons endomycètes, dont il existe un très grand nombre d'espèces : la plus connue est Saccharomyces cerevisiae (levure de bière), dont certaines souches sont utilisées en brasserie et d'autres en boulangerie ; Saccharomyces ellipsoideus, agent de la vinification ; Saccharomyces fragilis, employé pour la seconde fermentation intervenant en champagnisation.

– des moisissures (Aspergillus, Penicillium, Mucor).

Les tissus des végétaux supérieurs, conservés en anaérobiose, réalisent aussi une fermentation alcoolique (« fermentation propre ») : 100 g de pommes maintenues à 22 ⁰C en atmosphère d'azote produisent 600 mg d'alcool, en huit jours. La pratique de vinification, dite de « macération carbonique », correspond à une fermentation due au raisin lui-même.

Les substrats de la fermentation sont des sucres « fermentescibles » (saccharose, fructose, glucose, mannose), qui varient selon les espèces des agents de la fermentation. Deux considérations rendent compte du caractère non fermentescible de certains sucres : la membrane des cellules leur est imperméable et ne possède pas les perméases, ou systèmes spécifiques d'absorption, correspondantes ; les cellules sont dépourvues des systèmes enzymatiques capables de les métaboliser. Ainsi le saccharose est hydrolysé, mais à l'extérieur des cellules, par une β-fructosidase sécrétée par celles-ci ; le maltose est absorbé, puis hydrolysé à l'intérieur. Certains micro-organismes peuvent dégrader l'amidon : dans les brasseries, ce polyholoside est d'abord hydrolysé par les amylases végétales formées au cours de la germination des grains d'orge (maltage) ; puis les produits résultant de cette action enzymatique sont fermentés par les levures.

La fermentation est accélérée par addition d'ions phosphate et magnésium. Pasteur a précisé que, dans les conditions normales, 95 p. 100 seulement des sucres sont convertis en alcool et en gaz carbonique ; 5 p. 100 donnent des produits divers tels que le glycérol (de 3 p. 100 à 5 p. 100), l'acide succinique (≃ 0,5 p. 100), le butane-2,3-diol (≃ 0,5 p. 100).

La manifestation la plus connue de la fermentation homolactique est l'altération du lait. Certaines bactéries fermentent le lactose avec formation d'acide lactique ; l'acidification qui en résulte provoque la coagulation de la caséine ; ce dernier phénomène est retardé par addition de bicarbonate. Il y a fermentation homolactique quand la quantité d'acide lactique est très supérieure à celle des autres produits formés (de l'ordre de 80 p. 100 des sucres fermentés). La réaction globale s'écrit :

Les organismes responsables appartiennent surtout au genre Streptococcus et à certaines espèces de Lactobacillus (L. lactis, L. Caucasicus, L. Bulgaricus, L. casei, L. plantarum) et de Thermobacterium (T. yoghurti). Ils fermentent en général le glucose, le fructose, le mannose, le galactose, le saccharose et le lactose.

Suivant les organismes, l'isomère optique formé est soit l'acide D (−), soit l'acide L (+), soit la forme racémique. La proportion d'acide lactique formé varie en fonction du pH (87 p. 100 à pH 5, 61 p. 100 à pH 9 pour Streptococcus faecalis). Les autres produits accumulés sont l'acide acétique, l'acide formique, l'éthanol. La fermentation lactique est très utilisée en fromagerie. Les yaourts sont obtenus à partir de lait bouilli, refroidi, ensemencé avec une souche définie de bactérie (L. Bulgaricus par exemple) et incubé de 3 à 4 heures à 40 ⁰C. La fabrication de la choucroute est réalisée par fermentation lactique en présence de 2 à 3 p. 100 de chlorure de sodium. Le processus est arrêté lorsque la teneur en acide lactique atteint environ 1,5 p. 100. La fermentation lactique est favorisée lors de l'ensilage des produits agricoles, car l'acidité produite empêche le développement d'autres micro-organismes pouvant provoquer la putréfaction des produits ensilés. La présence de ferments lactiques dans la flore intestinale est très favorable à un bon fonctionnement de l'intestin. Enfin, au cours des processus anaérobies présidant à la contraction musculaire, le glycogène est transformé en acide lactique, lequel est ultérieurement oxydé au cours des processus aérobies. La rigidité cadavérique est due à la dénaturation des protéines musculaires par l'acide lactique accumulé.

De nombreuses bactéries appartenant aux genres Lactobacillus (L. brevis, L. fermenti), Leuconostoc (Leuc. mesenteroides, Leuc. pentosaceus) dégradent les hexoses avec formation quasi stœchiométrique d'une molécule de gaz carbonique, d'une molécule d'éthanol et d'une molécule d'acide lactique. Les sucres à cinq atomes de carbone (pentoses) peuvent parfois être fermentés et donnent alors une molécule d'éthanol et une molécule d'acide lactique. Outre ces produits, qui représentent plus de 80 p. 100 des sucres utilisés, on obtient également de l'acide acétique et du glycérol. Les fermentations hétérolactiques interviennent également en fromagerie.

Les exemples précédents montrent que les produits de dégradation peuvent être variés. C'est le cas le plus fréquent pour les fermentations bactériennes. Escherichia coli, anaérobie facultatif, dégrade le glucose en anaérobiose avec formation des produits suivants : acide acétique (45 p. 100 du glucose utilisé), acide succinique (5 p. 100), acide lactique (17 p. 100), acide formique (1 p. 100), gaz carbonique (13 p. 100), éthanol (16 p. 100), hydrogène (1 p. 100). Ces proportions varient beaucoup en fonction du pH du milieu : en milieu alcalin, l'acide formique est beaucoup plus important et il ne se dégage plus de gaz carbonique.

Elles sont le fait de bactéries anaérobies strictes appartenant presque exclusivement au genre Clostridium :

– Cl. butyricum, Cl. tyrobutyricum, Cl. lactoacetophilum dégradent l'amidon avec production de dioxyde de carbone (près de 45 p. 100 du glucose disparu), d'acide acétique (25 p. 100), d'acide butyrique (25 p. 100) et d'hydrogène. La gangrène gazeuse est due à l'infection, par des bactéries de ce type, de tissus non oxygénés du fait de la destruction par traumatisme de l'appareil circulatoire.

– Cl. perfringens, Cl. tetani produisent, en plus, de l'acide lactique et de l'éthanol. Cl. Pasteurianum, Cl. acetobutylicum donnent, en milieu acide, des quantités notables d'alcool butyrique et d'acétone, et, en milieu alcalin, surtout de l'acide butyrique.

L'accumulation d'acide propionique est réalisée par certaines bactéries, notamment du genre Propionibacterium, en utilisant des substrats variés, comme les sucres, le glycérol, l'acide lactique, l'acide malique. Cette fermentation, à partir d'acide lactique, joue un rôle en fromagerie (fabrication des fromages de gruyère). Les nématodes intestinaux, comme l'Ascaris, accumulent également de l'acide propionique.

L'ensemble des très nombreuses réactions biochimiques rendant compte de la transformation des sucres en produits de fermentation est difficile à décrire dans ses détails, mais on peut faire les commentaires d'ordre général suivants :

1. Le processus fondamental consiste en une oxydoréduction interne du sucre métabolisé sous l'action d'enzymes. Des réactions d'oxydation (III, 1, 11) portent sur une partie des atomes de carbone de la molécule catabolisée, lesquels s'oxydent (CO₂, radical −COOH). Elles produisent un pouvoir réducteur (NADH₂, NADPH₂, [H₂]), qui, au cours de réactions de réduction (4, 6, 8, 15, 17, 21, 23, 27), transforme l'autre fraction des atomes de carbone en radicaux : −CH₃, −CH₂, −CHOH ou −CH₂OH. De plus, des réactions de scission des liaisons carbone-carbone (II, III, IV, 5, 10, 11, 19) interviennent soit avant, soit après les réactions d'oxydation ; il en résulte que les produits fermentaires ont, dans la plupart des cas, des chaînes carbonées plus courtes que celles des substrats dégradés. Les réactions de réduction se situent, en général, en fin de processus.

2. Le pouvoir réducteur se trouve sous la forme de coenzymes réduits (nicotinamides ou flavines-nucléotides). On appelle déshydrogénases les enzymes qui catalysent les oxydoréductions. Selon les espèces, ces enzymes sont différents pour un même type de réaction et n'utilisent pas nécessairement les mêmes coenzymes. Ainsi, selon les micro-organismes, la réduction de l'acide pyruvique en acide lactique (4) peut se faire avec des enzymes fonctionnant directement avec le nicotinamide-nucléotide réduit (NADH), ou bien avec des enzymes du type de la flavo-protéine, le pouvoir réducteur étant alors transmis par le groupement prosthétique flavinique. Parfois, plusieurs types d'enzymes (ici la lactate déshydrogénase) effectuant la même réaction existent chez le même organisme, comme cela a été démontré pour Lactobacillus plantarum.

3. Les réactions intervenant au début des processus sont celles des grandes voies du métabolisme. Le point de départ est généralement le glucose-6-phosphate (I).

La majorité des organismes intéressés possèdent l'enzyme aldolase et dégradent le glucose par glycolyse (II, 1, 2, 3). Ce mécanisme aboutit à l'acide pyruvique ; la réaction fondamentale d'oxydation est celle qui est catalysée par la triose-phosphate déshydrogénase et elle fournit le pouvoir réducteur sous forme de NADH₂ (1). Selon l'équipement enzymatique propre à chaque espèce, l'acide pyruvique est utilisé au cours de diverses réactions (4, 5, 10, 26) aboutissant aux différents produits d'accumulation caractéristiques des fermentations décrites.

Les bactéries responsables des fermentations hétérolactiques ne possèdent pas d'aldolase. Les premières réactions sont celles de la voie dite des phosphopentoses ; elles consistent en l'oxydation complète du carbone n^o 1 du glucose-6-phosphate, avec émission de CO₂, formation de pentoses-5-phosphates et de pouvoir réducteur sous forme de NADPH₂ (III). Le pentose-5-phosphate est ensuite clivé par du phosphate minéral avec formation d'acétyl-phosphate et de phosphoglycéraldéhyde (IV).

4. Le bilan énergétique des différentes réactions est positif. En effet, les réactions d'oxydation fournissent suffisamment d'énergie (exergoniques), et les réactions de réduction sont le plus souvent spontanées. Les processus produisent ainsi plus d'ATP qu'ils n'en consomment essentiellement au cours des réactions de phosphorylation des sucres. Les réactions (1), (3), (12) permettent la formation d'ATP et la récupération, pour les besoins physiologiques, de l'énergie libérée par les processus.

Les êtres vivants sont utilisés comme moyen de fabrication, à partir d'une matière première de prix de revient le plus faible possible, d'une espèce chimique définie correspondant à un besoin économique. Pour les raisons qui vont être exposées, cette technologie est relativement onéreuse et elle ne présente d'intérêt que dans la mesure où la synthèse chimique, à partir de dérivés du pétrole par exemple, est impossible ou d'un coût plus élevé. Ces procédés de fabrication doivent résoudre à la fois des problèmes biologiques et des problèmes de génie chimique.

Les contraintes d'ordre biologique sont diverses.

– Pour la production industrielle, il est nécessaire de réaliser des cultures de micro-organismes en très grandes quantités dans des récipients, adaptés aux différents types de fabrication, nommés fermenteurs, dont le volume peut atteindre plusieurs centaines de litres. Ils doivent être thermostatés avec précision.

– Il est nécessaire que les cultures soient pures, c'est-à-dire qu'elles ne soient pas contaminées par des organismes étrangers utilisant la matière première et même le produit recherché ; on doit donc travailler dans des conditions d'asepsie rigoureuse.

– Il faut obtenir le meilleur rendement possible, ce qui implique une parfaite connaissance de la physiologie des organismes utilisés afin de définir les conditions de culture assurant ce rendement. Ainsi, la production d'acide citrique par des moisissures est optimale dans un milieu acide, carencé en fer et très aéré (forte agitation, insufflage d'air comprimé) ; la production d'acide gluconique est réalisée avec le même type d'organismes en milieu également très aéré, mais appauvri en azote et contenant du carbonate de calcium neutralisant l'acide gluconique formé. L'amélioration des rendements est obtenue en utilisant des organismes mutants (naturels ou isolés après irradiation ou traitement chimique de souches sauvages) qui ont conservé la possibilité de synthétiser le produit recherché, mais ont perdu celle de l'utiliser, ce qui provoque son accumulation. Il y a également intérêt à ce que cette accumulation soit suivie d'une exsorption dans le milieu de culture, la purification pouvant être plus aisée à partir du milieu qu'à partir des organismes.

La tendance actuelle est une automatisation de plus en plus poussée, avec un développement ininterrompu des cultures (technique du « chemostat »). Des détecteurs appropriés mesurent continuellement un certain nombre de paramètres biologiques et physico-chimiques de la culture tels que le nombre d'organismes, le pH, l'opacité, la concentration en aliment limitant, celle en produit fabriqué, etc. Ces informations, analysées par un ordinateur, commandent le prélèvement d'une partie de la culture (d'où l'on isolera le produit fabriqué) et l'apport de milieu neuf de façon à maintenir constante la composition du contenu du fermenteur, celle-ci devant être optimale pour la fabrication.

Les produits fabriqués ainsi biologiquement sont évidemment des substances organiques :

– des acides organiques : acide acétique, obtenu à partir d'éthanol par Acetobacter suboxydans, bactérie aérobie stricte, au cours de la fabrication du vinaigre ; acide citrique, par certaines espèces d'Aspergillus et de Penicillium (moisissure) ; acide gluconique, également par des espèces appartenant à ce genre ;

– des vitamines : vitamine B₁, par Eremothecium Ashbyii, Ashbya gossypii (champignons ascomycètes), Candida Guilliermondia (levure) ; vitamine B₁₂, par Streptomyces olivaceus ;

– des acides aminés : L-glutamate, par Micrococcus glutamicus ; L-lysine, par un mutant de cette espèce ;

– des alcaloïdes de l'ergot de seigle, par Claviceps purpurea, champignon responsable de la maladie du seigle ;

– tous les antibiotiques ;

– des dextrans (hauts polymères du glucose utilisés pour donner aux sérums physiologiques une pression osmotique et une viscosité convenables), par Leuconostoc mesenteroides (bactérie) ;

– le butanediol, qui a servi de matière première pour la fabrication des caoutchoucs artificiels butyl ; mais actuellement la fabrication chimique remplace la production par fermentation.

Cette liste n'est absolument pas restrictive et de nombreux autres composés sont ainsi fabriqués par voie biologique.