2. Caractéristiques communes à toutes les techniques immunocytologiques
• Réactifs immunologiques
Dans toutes les méthodes immunocytologiques, les meilleurs résultats sont obtenus avec des anticorps marqués, obtenus à partir d'antisérums provenant d'animaux hyperimmunisés. Ces antisérums contiennent généralement des titres élevés en anticorps, et possèdent une très grande affinité pour l'antigène correspondant. Une fois l'immunosérum obtenu, sa spécificité doit être testée rigoureusement. Si l'on observe des anticorps indésirables, ces derniers doivent être éliminés par des adsorptions appropriées. Pour éviter la formation de complexes solubles antigène-anticorps qui donnent des réactions faussement positives, il est préférable de procéder à ces adsorptions à l'aide d'immunoadsorbants, c'est-à-dire avec des antigènes immobilisés sur un support insoluble dans l'eau.
Les anticorps à marquer sont soit des fractions IgG provenant d'antisérums, soit des anticorps purifiés d'une façon spécifique. La préparation des fractions IgG est faite par des procédés de relargage salin suivis d'une chromatographie sur échangeurs d'ions. Bien que de bons résultats soient obtenus avec des IgG immunes marquées, il est préférable d'utiliser des anticorps purifiés qui donnent des résultats beaucoup plus reproductibles. Par ailleurs, la coloration non spécifique est, à leur niveau, beaucoup moins prononcée. Des immunoadsorbants sont utilisés pour préparer des anticorps purifiés.
En général, le marqueur est couplé avec l'anticorps à l'aide d'une réaction chimique appropriée. Une telle réaction, tout en permettant la préparation d'une quantité élevée d'anticorps marqué, doit préserver l'activité de l'anticorps et les propriétés du marqueur. Plusieurs techniques de couplage ont été décrites : elles suivent deux voies principales. Selon la première, des groupements fonctionnels sont d'abord introduits dans le marqueur, et on laisse ensuite l'anticorps réagir avec ce dérivé actif. Selon la seconde, le marqueur et l'anticorps sont mélangés et liés par l'intermédiaire de réactifs multifonctionnels.
La capacité de l'anticorps marqué à détecter l'antigène est évaluée en utilisant une préparation cellulaire que l'on sait contenir cet antigène et, par comparaison, avec un conjugué préalablement étudié, et dont on sait qu'il donne une réaction positive dans les mêmes conditions.
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